Академик
Ю.А.Овчинников
основатель Филиала
директор Института
1970-1988
ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ НАУКИ
ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
имени академиков М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН
(ФИБХ РАН)
Академик
М.М.Шемякин
основатель и
первый директор
Института
1959-1970

Руководитель:   Винокуров Леонид Михайлович, к.х.н.

   +7(4967)33-0537          

Фундаментальные исследования

   Резонансный перенос энергии биолюминесценции (BRET, Bioluminescence Resonance Energy Transfer) - явление, происходящее при взаимодействии люциферазы и флуоресцентного белка у ряда морских организмов. Энергия, возникающая при окислении люциферазой своего субстрата (донора) передается флуоресцентному белку (акцептору) и вызывает характерное свечение некоторых обитателей глубин. Эффективность BRET зависит от расстояния между донором и акцептором в нанометровом диапазоне, что позволяет с успехом применяться это явление в качестве "нанолинейки" для исследования взаимодействий биологических молекул.
   Сотрудниками группы была впервые реконструирована и исследована in vitro биолюминесцентная система медузы Aequorea victoria. Для этого были получены и исследованы гибридные белковые конструкции, объединяющие в составе одной полипептидной цепи белки акворин и зеленый флуоресцентный белок (GFP). Было обнаружено, что гибриды демонстрируют высокоэффективный BRET между акворином (донором) и GFP (акцептором), и люминесцируют в зеленой области спектра аналогично свечению медузы Aequorea victoria. Было показано, что в основе BRET между акворином и GFP лежит их Са2+ - индуцируемое взаимодействие, обеспечивающее должную ориентацию хромофоров этих белков. Проведенный сайт-направленный мутагенез GFP позволил картировать участки его поверхности, вовлеченные во взаимодействие с акворином, и пролить свет на молекулярный механизм явления BRET.
   С учетом полученных данных проводится реконструкция и исследование молекулярных основ биолюминесцентных систем ряда других организмов (полипа Оbelia longissima, медузы Gaussiа princeps, морской губки Renilla reniformis и др.). Кроме этого создаются химерные системы BRET с участием люминесцентных белков из различных неблизкородственных организмов (Discosoma sp., Anemonia sulcata и др.).

Биотехнологические исследования

Разработка биосенсоров
   С использованием BRET между акворином и GFP был разработан принципиально новый метод гомогенного анализа биотина, характеризующийся высокой чувствительностью и простотой проведения. Метод основан на межмолекулярном BRET, возникающем при взаимодействии стрептавидина и карбоксилазы BCCP, гибридизованных, соответственно с акворином и GFP. В присутствие биотина, конкурирующего с BCCP за связывание со стрептавидином, эффективность BRET снижается в зависимости от концентрации биотина, что приводит к изменению цвета биолюминесцентной реакции с зеленого на синий.
На основе гибридного белка акворин-GFP, содержащего в линкерном участке последовательность, специфически гидролизуемую протеазой каспаза-3, был разработан генетически-кодируемый наносенсор этой важной протеазы апоптоза. В нормальном состоянии клетки гибридная конструкция акворин-GFP характеризуется зеленым спектром биолюминесценции, однако при активации каспазы-3 происходит гидролиз линкерного участка между акворином и GFP, и наблюдается синий сдвиг спектра люминесценции.

Гетерологическая экспрессия в клетках E. coli
   В группе накоплен богатый опыт экспрессии чужеродных генов в клетках E. coli, а также разработаны и применяются эффективные стратегии рефолдинга и выделения гетерологических продуктов. Например, был предложен инновационный подход к экспрессии и очистке белков, основанный на в составе их гибридов с зеленым флуоресцентным белком. Было показано, что наряду с очевидным облегчением очистки целевого продукта, его гибридизация с GFP значительно увеличивает его выход в растворимой фракции. В составе гибридов с GFP была продемонстрирована успешная экспрессия ряда "проблемных" белков, а также коротких пептидов, в том числе токсичных для Е. coli.
   Еще в период "первичного накопления" мировых знаний о свойствах GFP, сотрудниками группы была опубликована пионерная работа, описывающая, пожалуй, самый простой, эффективный и цитируемый метод выделения GFP, основанный на его органической экстракции. В последние годы постоянно возрастающий интерес к расширению цветовой палитры флуоресцентных белков приводит к росту числа сообщений о новых клонированных GFP-подобных белках из различных организмов. Учитывая это, предложенный ранее подход к выделению GFP органической экстракцией был усовершенствован и с успехом продемонстрирован для очистки широкого ряда новых GFP-подобных белков.

Разработка диагностических систем
   Располагая широким арсеналом методов биоорганической химии, включая сайт-специфическую конъюгацию белков, а также соединений небелковой природы, сотрудниками Группы создаются новые репортерные биомолекулы с заданными свойствами. Среди них различные коньюгаты диагностических антител и антигенов белковой и небелковой природы, в том числе микотоксины (афлатоксин, охратоксин, зераленол, трихоценовые токсины). Репортерные свойства конъюгатов могут задаваться биолюминесцентнами белками (акворин, обелин, Renilla люцифераза, Gaussia люцифераза, пероксидаза) или разноцветными GFP-подобными флуоресцентными белками. Полученные конъюгаты используются в разработке диагностических систем с использованием как традиционного ИФА, так и инновационного формата BRET.

Основные публикации  »»»