Академик
Ю.А.Овчинников
основатель Филиала
директор Института
1970-1988
ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ НАУКИ
ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
имени академиков М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН
(ФИБХ РАН)
Академик
М.М.Шемякин
основатель и
первый директор
Института
1959-1970

Руководитель:   Бровко Федор Александрович, к.б.н.

   +7(4967)73-08-53          

Исследование молекулярных механизмов передачи цитокининовового сигнала в растении.

   Исследование передачи гормонального сигнала в растениях, на примере изучения механизмов передачи цитокининового сигнала у кукурузы и роли цитокинин-связывающих белков в этом процессе. Из этиолированных проростков кукурузы с помощью аффинной хроматографии на зеатин Toyopearl был выделен белок, с молекулярной массой 70 кД, он обратимо взаимодействовал с активными цитокининами, анти-идиотипическими антителами полученными к зеатину и гормон-зависимо активировал транскрипцию в присутствии хроматина, выделенного из зеленых листьев ячменя.
   Данный белок был назван ЦСБ70, к нему были получены моноклональные антитела. При проверке как антитела влияют на способность ЦСБ70 регулировать транскрипцию были обнаружено антитело способное ингибировать транскрипцию и ряд антител активирующих транскрипцию, при этом были антитела не влияющие на этот процесс. Для выяснения роли белка в развитии растения кукурузы изучали его локализацию в растении иммунохимическими методами. Было обнаружено, что наибольшее содержание белка наблюдается в клетках меристемы и клетках узла. При изучении внутриклеточной локализации ЦСБ70 методами световой и электронной микроскопии было обнаружено, что часть антител узнавали белок локализованный в ядре и цитоплазме, другая в этиопластах, пластидах и амилопластах, а часть антител не узнавала ЦСБ70 на срезах, но все антитела узнавали его в иммуноблотинге. Результаты иммуноцитохимических исследований показали, что содержание белка в клетках коррелирует с активностью в тканях процессов, зависящих от цитокининов или регулируемых цитокининами.
   Данные иммуноцитохимических исследований были подтверждены с помощью биохимических методов. Клетки были расфракционированы на органеллы и показано наличие ЦСБ70 в ядрах и хлоропластах. Используя эти данные был разработан метод выделения этиопластного цитокинин-связывающего белка с помощью аффинной хроматографии, отработаны условия рефолдинга белка. Белок показал высокий уровень активации гормон-зависимой транскрипции в присутствии ДНК хлоропластов кукурузы.
   Работа проводится совместно с лабораторией экпрессии генома растений института Физиологии растений им. К.А. Тимерязева УРАН и институтом Биологии Уфимского научного цента УРАН.

Публикации по результатам работы:
  1. Шепеляковская А.О., Теплова И.Р., Веселов Д.С., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А. Г., Васильева В.С., Кудоярова Г.Р., Холл М.А., Бровко Ф.А., Кулаева О.Н. Цитокинин-связывающий белок 70 кД преимущественно локализован в меристеме корня. Физиология Растений Т 49 , №1 стр133-120.
  2. Бровко Ф.А., Шепеляковская А.О., Бурханова Э.А., Бозиев Х.М., Ламан А.Г., Васильева В.С., Холл М.А., Кулаева О.Н. Преимущественная локализация цитокинин-связывающего белка (70кД) в апикальной меристеме корня. Доклады Академии Наук 2002 v 381 №5 с. 684-686.
  3. Fedor A. Brovko, Victoria S. Vasil'eva, Anna O. Shepelyakovskaya, Svetlana Yu. Selivankina, Guzel R. Kudoyarova, Alexander V. Nosov, Dmitry A. Moshkov, Alexander G. Laman, Khanafy M. Boziev, Victor V. Kusnetsov and Olga N. Kulaeva Cytokinin-binding protein (70 kDa): localization in tissues and cells of etiolated maize seedlings and its putative function. J Experimental Botany 58(10) 2007 pp2479-2490
Пептиды - миметики ГМДП

   Важным направлением исследований, проводимых в группе является получение пептидомиметиков мимикрирующих низкомолекулярные физиологически активные соединения. Уже более 30 лет в институте биоорганической химии проводятся исследования фрагмента клеточной стенки бактерий - глюкозаминиомурамоилдипептида (ГМДП), являющийся иммуноактиваторным веществом, с адьювантной активностью. К ГМДП в ИБХ УРАН были получены моноклональные антитела, которые узнавали и углеводную и пептидную части молекулы ГМДП. Используя эти антитела и 6- и 15-мерные фаговые пептидные библиотеки был открыт 15 мерный пептид, названный по концевым аминокислотным остаткам RN пептидом. Функциональные исследования RN пептида показали, что он обладает адьювантной активностью, превышающей аналогичную у исходного соединения ГМДП, и в отличии от ГМДП не обладает пирогенным эффектом. В настоящее время проводятся исследования по оптимизации структуры, с целью получения более активных аналогов.
   Исследования проводятся совместно с лабораторий иммунохимии ИБХ УРАН.

Публикации по результатам работы:
  1. Laman A.G, Shepelyakovskaya A.O., Rodionov I.L., Malachova G. V., Brovko F.A., Korpela T., Nesmryanov V.A. Method for finding novel peptide adjuvant. Number FI20040812, priority date 14th June 2004.
  2. Laman Alexander Georgievich, Shepelyakovskaya Anna Olegovna, Berezin Igor Anatolevich, Boziev Khanafi Magometovich, Rodionov Igor Leonidovich, Chulina Irina Alexandrovna, Malakhova Galina Vladimirovna, Brovko Fedor Alexandrovich, Murashev Arkadi Nikolaevich, Korpela Timo Kalevi, Nesmeyanov Vladimir Andreevich Identification of pentadecapeptide mimicking muramyl peptide Vaccine v25 (2007) pp2900-2906
Публикации по результатам работы:
  1. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Улитин А.Б., Маркова Е.В., Мареева Т. Ю., Быстров Н.С., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А. Получение мини-антител против гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека с использованием библиотеки scFv мыши. Биоорганическая Химия, 2002. Т 28, стр126-134
  2. Улитин А.Б., Капралова М.В., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Булгакова Е.В., Фурсова К.К., Аббасова С.Г., Волков С.К., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А. Библиотека мини-антител человека в формате фагового дисплея. Создание и апробация. Доклады Академии наук, v 405, № 4, с. 1-4. 2005
  3. Костеша Н.В., Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Зайцева И.С., Орлов В.П., Дыкман Л.А., Бровко Ф.А., Соколов О.И. Селекция и характеристика фаговых мини-антител к актинан различного происхождения. БИОХИМИЯ, том 70, вып. 8, с. 1070 - 1077 2005
  4. Дубровская В.В., Тикунова Н.В., Морозова В.В., Бормотов Н.И., Ламан А.Г., Улитин А.Б., Бровко Ф.А., Беланов Е.Ф., Ильичев А.А. Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-3A10, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное антитело человека 3A10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005125994 от 15.08.05
  5. Батанова Т.А., Улитин,. А.Б., Жираковская Е. В, Ламан А.Г., Бровко Ф. А., Воронина В.В., Тикунова Н. В. СОЗДАНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НАИВНОЙ КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология том 3:стр35-41. 2006
  6. Дубровская В.В., Улитин А.Б., Ламан А.Г., Гилева И.П., Бормотов Н.И., Ильичев А.А., Бровко Ф.А Щелкунов С.Н., Беланов Е.Ф., Тикунова Н.В. Конструирование комбинаторной иммунной библиотеки одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов и получение из нее антител к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы Молекулярная Биология том 41 №1 2007
  7. Батанова Т.А., Улитин,. А.Б., Жираковская Е. В, Ламан А.Г., Бровко Ф. А., Воронина В.В., Тикунова Н. В.СОЗДАНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ НАИВНОЙ КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология том 3:стр35-41
  8. Fursova KK, Laman AG, Melnik BS, Semisotnov GV, Kopylov PKh, Kiseleva NV, Nesmeyanov VA, Brovko FA. Refolding of scFv mini-antibodies using size-exclusion chromatography via arginine solution layer. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009 V.877 pp.2045-2051.
Рекомбинантные антитела для диагностики и терапии.

   Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной биотехнологии является получение и производство рекомбинанатных антител. В настоящее время представляет интерес получение полностью человеческих антител, такие антитела мало иммуногенны, способны эффективно длительное время находиться в крови и осуществлять нейтрализацию токсинов, патогенов, вирусов, уничтожать или участвовать в уничтожении опухолевых или других вредных для организма клеток. Исследования по этому направлению проводятся и в нашей группе. Важным этапом в получении рекомбинантных антител человека является создание представительных библиотек антител. Наиболее часто используемым форматом является фаговый дисплей. Из таких библиотек можно получать антиген-узнающие фрагменты антител, а затем на их основе создавать как полноразмерные антитела, так и всевозможные конструкции на основе антиген-узнающего участка.
   Начало им было положено созданием наивной библиотеки мышиных миниантител в формате фагового дисплея. Далее была создана библиотека миниантител человека, в таком же формате. В настоящее время основная работа проводится с использованием библиотеки миниантител человека. Из нее получены антитела к антигенам возбудителя чумы Yersinia pestis и энтеротоксинам стафилококков.
   Работа проводится совместно с ИБХ УРАН, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, ГНЦ Прикладной Микробиологии Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Конструирование диагностических систем на основе антител.

   Одним из важных для здоровья человека является благоприятное нахождение с окружающими нас микроорганизмами. Многие микроорганизмы являются не совсем желанными для общения, а контакты с ними приводят к различным заболеваниям. Одним из таких опасных возбудителей является микроорганизм Staphylococcus aureus. Этот микроорганизм продуцирует большой набор токсинов, которые могут кодироваться как в геноме, так и фагами и плазмидами. При этом важно не то, какую последовательность токсина содержит микроорганизм, а сколько он его производит. Энтеротоксины стафилококков стабильны при термической обработке, устойчивы к действию протеолитических ферментов при экстремальных значениях рН. Попадая в организм они вызывают отравление. Многократное воздействие этих токсинов является причиной ряда серьезных осложнений и приводит к развитию аутоиммунных заболеваний и аллергий.
   При решении задач по анализу содержания токсинов в секретах человека, продуктах или пищевом сырье, окружающей среде важнейшими являются иммунохимические методы анализа. Получением моноклональных антител к токсинам продуцируемым Staphylococcus aureus является одним из направлений исследований проводимых в группе. Кроме токсинов Staphylococcus aureus получаем моноклональные антитела и к другим токсинам. На основе полученных антител создаются диагностикумы для обнаружения токсинов.
   Работа проводится совместно с ИБХ УРАН, ИМБ УРАН, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, ГНЦ Прикладной Микробиологии Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Публикации по результатам работы:
  1. А.В. Молодкин, С.Г. Аббасова, Н.А. Назаров, Н.В. Балохина, В.С. Васильева, Х.М. Бозиев, Ф.А. Бровко, К.Н. Груздев, Моноклональные антитела к вирусу бешенства С.С. Рыбаков Ветеринарная патология т 66 (4) стр. 143-152 2006